Статья 6.1. Особенности условий кредитного договора, договора займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой

КонсультантПлюс: примечание.

С 03.07.2022 ст. 6 дополняется ч. 12 (ФЗ от 02.07.2021 N 329-ФЗ).

(введена Федеральным законом от 05.12.2017 N 378-ФЗ)

1. Деятельность по предоставлению кредитов (займов) физическим лицам в целях, не связанных с осуществлением ими предпринимательской деятельности, и обязательства заемщиков по которым обеспечены ипотекой, может осуществляться кредитными организациями, кредитными потребительскими кооперативами, сельскохозяйственными кредитными потребительскими кооперативами, учреждением, созданным по решению Правительства Российской Федерации для обеспечения функционирования накопительно-ипотечной системы жилищного обеспечения военнослужащих и реализации Министерством обороны Российской Федерации функций уполномоченного федерального органа исполнительной власти, обеспечивающего функционирование накопительно-ипотечной системы военнослужащих, единым институтом развития в жилищной сфере, а также организациями, осуществляющими деятельность по предоставлению ипотечных займов в соответствии с требованиями, установленными единым институтом развития в жилищной сфере, и включенными в перечень уполномоченных единым институтом развития в жилищной сфере организаций, осуществляющих деятельность по предоставлению ипотечных займов. (часть 1 в ред. Федерального закона от 02.08.2019 N 271-ФЗ)

(см. текст в предыдущей редакции)

1.1. Перечень уполномоченных единым институтом развития в жилищной сфере организаций, осуществляющих деятельность по предоставлению ипотечных займов, подлежит опубликованию на официальном сайте единого института развития в жилищной сфере в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет». Порядок формирования перечня уполномоченных единым институтом развития в жилищной сфере организаций, осуществляющих деятельность по предоставлению ипотечных займов, а также требования, предъявляемые к включаемым в него организациям, устанавливаются Правительством Российской Федерации.(часть 1.1 введена Федеральным законом от 02.08.2019 N 271-ФЗ)1.2. Микрофинансовые организации вправе осуществлять деятельность по предоставлению займов физическим лицам в целях, не связанных с осуществлением ими предпринимательской деятельности, и обязательства заемщиков по которым обеспечены ипотекой, с учетом ограничений, установленных Федеральным законом от 2 июля 2010 года N 151-ФЗ «О микрофинансовой деятельности и микрофинансовых организациях». (часть 1.2 введена Федеральным законом от 02.08.2019 N 271-ФЗ)1.3. Кредитные потребительские кооперативы вправе осуществлять деятельность по предоставлению займов физическим лицам в целях, не связанных с осуществлением ими предпринимательской деятельности, и обязательства заемщиков по которым обеспечены ипотекой, с учетом ограничений, установленных Федеральным законом от 18 июля 2009 года N 190-ФЗ «О кредитной кооперации».(часть 1.3 введена Федеральным законом от 02.08.2019 N 271-ФЗ)1.4. Сельскохозяйственные кредитные потребительские кооперативы вправе осуществлять деятельность по предоставлению займов физическим лицам в целях, не связанных с осуществлением ими предпринимательской деятельности, и обязательства заемщиков по которым обеспечены ипотекой, с учетом ограничений, установленных Федеральным законом от 8 декабря 1995 года N 193-ФЗ «О сельскохозяйственной кооперации».(часть 1.4 введена Федеральным законом от 02.08.2019 N 271-ФЗ)1.5. Требования частей 1 и 1.2 настоящей статьи не распространяются на займы, предоставляемые работодателем работнику в целях, не связанных с осуществлением работником предпринимательской деятельности, и обязательства по которым обеспечены ипотекой. (часть 1.5 введена Федеральным законом от 02.08.2019 N 271-ФЗ)2. В кредитном договоре, договоре займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой, должна быть определена полная стоимость кредита (займа), обеспеченного ипотекой, в соответствии с требованиями, установленными настоящим Федеральным законом. Требования настоящей части по определению полной стоимости кредита (займа) и размещению информации о полной стоимости кредита (займа) на первой странице кредитного договора, договора займа не распространяются на договоры целевого жилищного займа, заключенные в соответствии с Федеральным законом от 20 августа 2004 года N 117-ФЗ «О накопительно-ипотечной системе жилищного обеспечения военнослужащих». К кредитному договору, договору займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой, также применяются требования настоящего Федерального закона в части:(в ред. Федерального закона от 02.08.2019 N 271-ФЗ)

(см. текст в предыдущей редакции)

1) размещения информации о полной стоимости кредита (займа) на первой странице кредитного договора, договора займа;

2) запрета на взимание кредитором вознаграждения за исполнение обязанностей, возложенных на него нормативными правовыми актами Российской Федерации, а также за услуги, оказывая которые кредитор действует исключительно в собственных интересах и в результате предоставления которых не создается отдельное имущественное благо для заемщика;

3) размещения информации об условиях предоставления, использования и возврата кредита (займа) в местах оказания услуг (местах приема заявлений о предоставлении кредита (займа), в том числе в информационно-телекоммуникационной сети «Интернет»), а также в части доведения до сведения заемщика иной предусмотренной настоящим Федеральным законом информации;

4) предоставления заемщику графика платежей по кредитному договору, договору займа;

5) бесплатного осуществления кредитором операций по банковскому счету заемщика, если условиями кредитного договора, договора займа предусмотрено его открытие;

6) размещения условий кредитного договора, договора займа, перечень которых определен пунктами 1 — 13, 15 и 16 части 9 статьи 5 настоящего Федерального закона, в виде таблицы, форма которой установлена нормативным актом Банка России, начиная с первой страницы такого договора, четким, хорошо читаемым шрифтом. (п. 6 введен Федеральным законом от 02.08.2019 N 271-ФЗ)3. В расчет полной стоимости потребительского кредита (займа) по кредитному договору, договору займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой, наряду с платежами заемщика, указанными в частях 3 и 4 статьи 6 настоящего Федерального закона, — для полной стоимости потребительского кредита (займа), выраженной в процентах годовых, и платежами заемщика, указанными в части 3 и пунктах 2 — 7 части 4 статьи 6 настоящего Федерального закона, — для полной стоимости потребительского кредита (займа) в денежном выражении включается сумма страховой премии, выплачиваемой заемщиком по договору страхования предмета залога, обеспечивающего требования к заемщику по договору потребительского кредита (займа).

КонсультантПлюс: примечание.

С 03.07.2022 ст. 6.1 дополняется ч. 3.1 (ФЗ от 02.07.2021 N 329-ФЗ). 4. По кредитному договору, договору займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой, определяется примерный размер среднемесячного платежа заемщика, рассчитываемый в порядке, установленном Банком России, и носящий информационный характер. Примерный размер среднемесячного платежа заемщика размещается в квадратной рамке справа от информации о полной стоимости потребительского кредита (займа) в денежном выражении и наносится цифрами и прописными буквами. Площадь квадратной рамки должна составлять не менее чем 5 процентов площади первой страницы кредитного договора, договора займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой.

КонсультантПлюс: примечание.

С 03.07.2022 в ч. 5 ст. 6.1 вносятся изменения (ФЗ от 02. 07.2021 N 329-ФЗ).5. Размер неустойки (штрафа, пени) за неисполнение или ненадлежащее исполнение заемщиком обязательств по возврату кредита (займа) и (или) уплате процентов за пользование кредитом (займом) по кредитному договору, договору займа, которые заключены с физическим лицом в целях, не связанных с осуществлением им предпринимательской деятельности, и обязательства заемщика по которым обеспечены ипотекой, не может превышать размер ключевой ставки Центрального банка Российской Федерации на день заключения соответствующего договора в случае, если по условиям кредитного договора, договора займа проценты за соответствующий период нарушения исполнения обязательств начисляются, или 0,06 процента от суммы просроченной задолженности за каждый день нарушения исполнения обязательств в случае, если по условиям кредитного договора, договора займа проценты за пользование кредитом (займом) за соответствующий период нарушения обязательств не начисляются.6. В кредитном договоре (договоре займа), обязательства по которому обеспечены ипотекой, должна содержаться информация о праве заемщика обратиться к кредитору с требованием, указанным в части 1 статьи 6.1-1 настоящего Федерального закона, и об условиях, при наступлении которых у заемщика возникает соответствующее право. При этом указанная информация должна быть размещена на первой странице кредитного договора (договора займа).(часть 6 введена Федеральным законом от 01.05.2019 N 76-ФЗ)

КонсультантПлюс: примечание.

При изменении условий кредитного договора (займа) на основании ФЗ от 03.04.2020 N 106-ФЗ заемщик вправе изменить их условия в соответствии со ст. 6.1-1 только после окончания льготного периода.

отсрочка по ипотеке — СберБанк

Документы —
Правительство России

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЗАКОН

О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа

Принят Государственной Думой                              1 апреля 2020 года

Одобрен Советом Федерации                                   2 апреля 2020 года

Статья 1

Внести в Федеральный закон от 10 июля 2002 года № 86-ФЗ «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2002, № 28, ст.  2790; 2004, № 31, ст. 3233; 2005, № 25, ст. 2426; 2006, № 25, ст. 2648; 2008, № 44, ст. 4982; 2010, № 45, ст. 5756; 2011, № 27, ст. 3873; № 43, ст. 5973; № 48, ст. 6728; 2013, № 30, ст. 4084; № 49, ст. 6336; № 52, ст. 6975; 2014, № 30, ст. 4219; № 52, ст. 7543; 2015, № 27, ст. 4001; 2016, № 1, ст. 46; 2017, № 14, ст. 1997; № 18, ст. 2661; № 30, ст. 4456; 2018, № 11, ст. 1584, 1588; № 18, ст. 2557; № 24, ст. 3400; № 32, ст. 5115; 2019, № 27, ст. 3538; № 29, ст. 3857; № 31, ст. 4423, 4430; № 52, ст. 7787) следующие изменения:

1) статью 4 дополнить пунктами 186 и 187 следующего содержания:

«186) во взаимодействии с Правительством Российской Федерации реализует мероприятия по повышению уровня финансовой грамотности населения и субъектов малого и среднего предпринимательства в Российской Федерации;

187) во взаимодействии с Правительством Российской Федерации разрабатывает и проводит политику по обеспечению доступности финансовых услуг для населения и субъектов малого и среднего предпринимательства в Российской Федерации;»;

2) часть первую статьи 18 дополнить пунктом 1713 следующего содержания:

«1713) утверждает стратегию повышения доступности финансовых услуг в Российской Федерации;»;

3) главу VII1 дополнить статьями 454 и 455 следующего содержания:

«Статья 454.  Банк России во взаимодействии с Правительством Российской Федерации реализует мероприятия по повышению уровня финансовой грамотности населения и субъектов малого и среднего предпринимательства в Российской Федерации.

Статья 455. Банк России во взаимодействии с Правительством Российской Федерации разрабатывает и проводит политику по обеспечению доступности финансовых услуг для населения и субъектов малого и среднего предпринимательства в Российской Федерации.

Банк России один раз в три года принимает стратегию повышения доступности финансовых услуг в Российской Федерации.».

Статья 2

Внести в Федеральный закон от 16 июля 1998 года № 102-ФЗ «Об ипотеке (залоге недвижимости)» (Собрание законодательства Российской Федерации, 1998, № 29, ст. 3400; 2002, № 7, ст. 629; 2005, № 1, ст. 42; 2008, № 52, ст. 6219; 2009, № 1, ст. 14; 2011, № 50, ст. 7347; 2016, № 27, ст. 4294; 2017, № 48, ст. 7052; 2019, № 18, ст. 2200) следующие изменения:

1) абзац первый пункта 1 статьи 10 дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»;

2) в пункте 11 статьи 131:

а) абзац первый после слов «Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)» дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»;

б) абзац четвертый дополнить словами «(за исключением случая изменения условия обязательства, обеспеченного ипотекой, в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»)»;

3) абзац первый пункта 11 статьи 134 после слов «Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)» дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа», после слов «третье лицо» дополнить словами «(за исключением случая изменения условия обязательства, обеспеченного ипотекой, в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»)»;

4) абзац первый пункта 11 статьи 136 после слов «Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)» дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа», после слов «третье лицо» дополнить словами «(за исключением случая изменения условия обязательства, обеспеченного ипотекой, в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»)»;

5) в пункте 2 статьи 23:

а) абзац второй после слов «Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)» дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»;

6) абзац четвертый дополнить словами «(за исключением случая изменения условия обязательства, обеспеченного ипотекой, в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»)».

Статья 3

Внести в Федеральный закон от 11 ноября 2003 года № 152-ФЗ «Об ипотечных ценных бумагах» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2003, № 46, ст. 4448; 2005, № 1, ст. 19; 2006, № 31, ст. 3440; 2012, № 53, ст. 7606; 2013, № 30, ст. 4084; № 51, ст. 6699; 2016, № 1, ст. 81; 2018, № 53, ст. 8440; 2019, № 18, ст. 2200; № 31, ст. 4420) следующие изменения:

1) часть 7 статьи 13 после слов «Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)» дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»;

2) абзац четвертый части 1 статьи 14 дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа».

Статья 4

Внести в статью 4 Федерального закона от 30 декабря 2004 года № 218-ФЗ «О кредитных историях» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2005, № 1, ст. 44; № 30, ст. 3121; 2013, № 51, ст. 6683; 2014, № 26, ст. 3395; 2015, № 1, ст. 29; № 27, ст. 3945; 2017, № 1, ст. 9; 2018, № 32, ст. 5120; 2019, № 18, ст. 2200, 2201) следующие изменения:

1) подпункт «г» пункта 2 части 3 дополнить словами «или в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»;

2) часть 41-1 дополнить словами «, а также информация об отсутствии платежей по договору займа (кредита), которые не уплачены в течение льготного периода, предоставленного в соответствии со статьями 6 и 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа»;

3) подпункт «г» пункта 2 части 7 дополнить словами «, а также отдельно о внесении изменений и (или) дополнений к договору займа (кредита) по требованию заемщика в соответствии со статьей 7 Федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон «О Центральном банке Российской Федерации (Банке России)» и отдельные законодательные акты Российской Федерации в части особенностей изменения условий кредитного договора, договора займа».

Статья 5

Часть 15 статьи 61-1 Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, № 51, ст. 6673; 2019, № 18, ст. 2200) после слов «льготного периода» дополнить словами «не допускается начисление неустойки (штрафа, пени) за неисполнение или ненадлежащее исполнение заемщиком обязательств по возврату кредита (займа) и (или) уплате процентов на сумму кредита (займа), за исключением неисполнения или ненадлежащего исполнения заемщиком обязательств по уплате в течение льготного периода платежей, размер которых был уменьшен на основании его требования, указанного в части 1 настоящей статьи, а также», дополнить предложением следующего содержания: «Сумма процентов, неустойки (штрафа, пени) за неисполнение или ненадлежащее исполнение заемщиком обязательств по возврату кредита (займа) и (или) уплате процентов на сумму кредита (займа), не уплаченная заемщиком до установления льготного периода, фиксируется и уплачивается после уплаты в соответствии с частью 20 настоящей статьи платежей, указанных в части 18 настоящей статьи. «.

Статья 6

1. Заемщик — физическое лицо, индивидуальный предприниматель (далее в настоящей статье — заемщик), заключивший до дня вступления в силу настоящего Федерального закона с кредитором, указанным в пункте 3 части 1 статьи 3 Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)», кредитный договор (договор займа), в том числе кредитный договор (договор займа), обязательства по которому обеспечены ипотекой, вправе в любой момент в течение времени действия такого договора, но не позднее 30 сентября 2020 года обратиться к кредитору с требованием об изменении условий такого договора, предусматривающим приостановление исполнения заемщиком своих обязательств на срок, определенный заемщиком (далее — льготный период), при одновременном соблюдении следующих условий:

1) размер кредита (займа), предоставленного по такому кредитному договору (договору займа), не превышает максимального размера кредита (займа), установленного Правительством Российской Федерации для кредитов (займов), по которому заемщик вправе обратиться с требованием к кредитору о предоставлении льготного периода в соответствии с настоящим Федеральным законом, в случае такого установления. Максимальный размер кредита (займа) для кредитов (займов), по которому заемщик вправе обратиться с требованием к кредитору о предоставлении льготного периода, может быть установлен Правительством Российской Федерации в абсолютном значении и (или) в относительном значении в зависимости от дохода заемщика с учетом региональных особенностей;

2) снижение дохода заемщика (совокупного дохода всех заемщиков по кредитному договору (договору займа) за месяц, предшествующий месяцу обращения заемщика с требованием, указанным в настоящей части, более чем на 30 процентов по сравнению со среднемесячным доходом заемщика (совокупным среднемесячным доходом заемщиков) за 2019 год. Правительство Российской Федерации вправе определить методику расчета среднемесячного дохода заемщика (совокупного среднемесячного дохода заемщиков) для целей применения настоящей статьи;

3) на момент обращения заемщика с требованием, указанным в настоящей части, в отношении такого кредитного договора (договора займа) не действует льготный период, установленный в соответствии со статьей 61-1 Федерального закона от 21 декабря 2013 года № 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)».

2. Указанное в части 1 настоящей статьи требование заемщика — индивидуального предпринимателя вместо приостановления исполнения заемщиком своих обязательств может предусматривать уменьшение размера платежей в течение льготного периода. Заемщик — индивидуальный предприниматель не вправе обратиться к кредитору в соответствии с настоящей статьей с требованием об изменении условий кредитного договора (договора займа), в отношении которого был установлен льготный период по требованию этого заемщика в соответствии со статьей 7 настоящего Федерального закона.

3. Требование заемщика, указанное в части 1 настоящей статьи, должно содержать указание на приостановление исполнения своих обязательств по кредитному договору (договору займа) или в случае, предусмотренном частью 2 настоящей статьи, на уменьшение размера платежей в течение льготного периода. В требовании заемщик указывает, что льготный период устанавливается в соответствии с настоящим Федеральным законом.

4. Заемщик вправе определить длительность льготного периода не более шести месяцев, а также дату начала льготного периода. Дата начала льготного периода не может отстоять более чем на 14 дней, предшествующих обращению с требованием, указанным в части 1 настоящей статьи. Дата начала льготного периода по кредитному договору (договору займа), обязательства по которому обеспечены ипотекой, не может отстоять более чем на один месяц, предшествующий обращению с требованием, указанным в части 1 настоящей статьи. В случае, если заемщик в своем требовании не определил длительность льготного периода, а также дату начала льготного периода, льготный период считается равным шести месяцам, а датой начала льготного периода считается дата направления требования заемщика кредитору.

5. Требование заемщика, указанное в части 1 настоящей статьи, представляется кредитору способом, предусмотренным договором, или с использованием средств подвижной радиотелефонной связи с абонентского номера, информация о котором предоставлена заемщиком кредитору. Кредитор обязан обеспечить возможность получения от заемщика требования, указанного в части 1 настоящей статьи, с использованием средств подвижной радиотелефонной связи.

6. Кредитор, получивший требование заемщика, указанное в части 1 настоящей статьи, в срок, не превышающий пяти дней, обязан рассмотреть указанное требование и в случае его соответствия требованиям настоящей статьи сообщить заемщику об изменении условий кредитного договора (договора займа) в соответствии с представленным заемщиком требованием, направив ему уведомление способом, предусмотренным договором, а в случае, если требование заемщика было направлено с использованием средств подвижной радиотелефонной связи, также по абонентскому номеру подвижной радиотелефонной связи, информация о котором предоставлена кредитору заемщиком.

7. Условие, указанное в пункте 2 части 1 настоящей статьи, считается соблюденным, пока не доказано иное. Кредитор вправе запросить у заемщика документы, подтверждающие соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи. В этом случае заемщик обязан представить указанные документы не позднее 90 дней после дня представления им кредитору требования, указанного в части 1 настоящей статьи. В случае непредставления заемщиком в установленный срок документов, подтверждающих соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи, срок их представления продлевается кредитором на 30 дней при наличии у заемщика уважительных причин непредставления таких документов в установленный срок, о которых заемщик должен известить кредитора. Непредставление заемщиком указанных документов до окончания предусмотренного частью 6 настоящей статьи предельного срока рассмотрения кредитором требования заемщика не является основанием для отказа заемщику в изменении условий кредитного договора (договора займа). Кредитор обязан не позднее пяти дней после дня представления заемщиком документов, подтверждающих соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи, или после дня получения информации по своему запросу в соответствии с частью 8 настоящей статьи рассмотреть указанные документы (информацию) и в случае, если такие документы (информация) подтверждают соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи, направить заемщику уведомление о подтверждении установления льготного периода. Кредитор направляет заемщику указанное уведомление способом, предусмотренным договором, а в случае, если требование заемщика было направлено с использованием средств подвижной радиотелефонной связи, также по абонентскому номеру подвижной радиотелефонной связи, информация о котором предоставлена кредитору заемщиком. В случае направления кредитором заемщику уведомления о подтверждении установления льготного периода или в случае, если кредитор не воспользовался предусмотренным настоящей частью правом в течение 60 дней после дня получения требования заемщика, указанного в части 1 настоящей статьи, установление льготного периода признается подтвержденным.

8. Кредитор вправе запросить информацию, подтверждающую соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи, в федеральном органе исполнительной власти, осуществляющем функции по контролю и надзору за соблюдением законодательства о налогах и сборах, Пенсионном фонде Российской Федерации, Фонде социального страхования Российской Федерации, Федеральном фонде обязательного медицинского страхования. Кредитор, направивший указанный запрос, не вправе запрашивать у заемщика документы, подтверждающие соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи. Согласие заемщика на предоставление указанной информации считается полученным с момента направления заемщиком требования, указанного в части 1 настоящей статьи. Кредитор обязан проинформировать заемщика о факте направления указанного запроса, а также о содержании полученной по запросу информации, если она указывает на несоответствие представленного заемщиком требования, указанного в части 1 настоящей статьи, условию, указанному в пункте 2 части 1 настоящей статьи. В этом случае заемщик вправе представить документы, подтверждающие условие, указанное в пункте 2 части 1 настоящей статьи, в срок, предусмотренный частью 7 настоящей статьи.

9. Если не установлено иное, документами, подтверждающими соблюдение условия, указанного в пункте 2 части 1 настоящей статьи, могут являться:

1) справка о полученных физическим лицом доходах и удержанных суммах налога по форме, утвержденной федеральным органом исполнительной власти, осуществляющим функции по контролю и надзору за соблюдением законодательства о налогах и сборах, за текущий год и за 2019 год;

2) выписка из регистра получателей государственных услуг в сфере занятости населения — физических лиц о регистрации гражданина в качестве безработного в соответствии с пунктом 1 статьи 3 Закона Российской Федерации от 19 апреля 1991 года № 1032-I «О занятости населения в Российской Федерации»;

Вступают в силу изменения в Федеральный закон №353-ФЗ

С 24 июня 2018 года вступают в силу изменения в Федеральный закон №353-ФЗ от 21.12.2013 N 353-ФЗ (ред. от 05.12.2017) «О потребительском кредите (займе)» и Указание Банка России от 15.05.2018 N 4794-У «О внесении изменений в приложение к Указанию Банка России от 23 апреля 2014 года N 3240-У «О табличной форме индивидуальных условий договора потребительского кредита (займа)» согласно которым, в договорах потребительского займа должен измениться порядок отражения ПСК и суммы расходов заемщика

С 24 июня 2018 года вступают в силу изменения в Федеральный закон №353-ФЗ от 21.12.2013 N 353-ФЗ (ред. от 05.12.2017) «О потребительском кредите (займе)» и Указание Банка России от 15.05.2018 N 4794-У «О внесении изменений в приложение к Указанию Банка России от 23 апреля 2014 года N 3240-У «О табличной форме индивидуальных условий договора потребительского кредита (займа)» согласно которым, в договорах потребительского займа должен измениться порядок отражения ПСК и суммы расходов заемщика.

Изменения внесены в ст. 6 Полная стоимость потребительского кредита (займа) Федерального закона №353-ФЗ от 21.12.2013 N 353-ФЗ (ред. от 05.12.2017) «О потребительском кредите (займе)»

Новая редакция части 1 ст.6 Полная стоимость потребительского кредита:

«1. Полная стоимость потребительского кредита (займа) определяется как в процентах годовых, так и в денежном выражении и рассчитывается в порядке, установленном настоящим Федеральным законом. Полная стоимость потребительского кредита (займа) размещается в квадратных рамках в правом верхнем углу первой страницы договора потребительского кредита (займа) перед таблицей, содержащей индивидуальные условия договора потребительского кредита (займа), и наносится цифрами и прописными буквами черного цвета на белом фоне четким, хорошо читаемым шрифтом максимального размера из используемых на этой странице размеров шрифта. Полная стоимость потребительского кредита (займа) в денежном выражении размещается справа от полной стоимости потребительского кредита (займа), определяемой в процентах годовых. Площадь каждой квадратной рамки должна составлять не менее чем 5 процентов площади первой страницы договора потребительского кредита (займа).»

Указание Банка России от 15.05.2018 N 4794-У «О внесении изменений в приложение к Указанию Банка России от 23 апреля 2014 года N 3240-У «О табличной форме индивидуальных условий договора потребительского кредита (займа)» вносит изменения в следующие разделы таблицы индивидуальных условий договора потребительского кредита (займа):

Строка 4 должна быть изложена в следующей редакции:

4. Процентная ставка (процентные ставки) в процентах годовых, а при применении переменной процентной ставки — порядок ее определения, соответствующий требованиям Федерального закона от 21 декабря 2013 года N 353-ФЗ «О потребительском кредите (займе)», ее значение на дату предоставления заемщику индивидуальных условий

Строка 5 должна быть дополнена Строкой 5.1 следующего содержания:

5.1. Указание на изменение суммы расходов заемщика при увеличении используемой в договоре переменной процентной ставки потребительского кредита (займа) на один процентный пункт начиная со второго очередного платежа на ближайшую дату после предполагаемой даты заключения договора

Микрофинансирование | Банк России

Микрофинансовые организации

Микрофинансирование организаций (МФО) коммерческих
или некоммерческие организации, кроме банков, которые предоставляют ссуды в соответствии с
Федеральным законом от 2 июля 2010 г. № 151-ФЗ «О микрофинансовой деятельности.
и микрофинансовые организации ». Кредиты могут выдаваться как гражданам, так и
компании или индивидуальные предприниматели. Надзор за деятельностью МФО осуществляется
осуществляется Банком России.

МФО обычно
средние и малые компании. МФО не связаны многими банковскими коэффициентами, поскольку они
не привлекают средства граждан, что позволяет им использовать индивидуальный подход
к оценке заемщиков и предоставлять ссуды быстрее и менее формализованно, чем банки
во многих случаях. Кроме того, МФО часто работают в местах, где
офисы отсутствуют.

С 1 июля 2014 г.
В действие вступил Федеральный закон от 21 декабря 2013 г. № 353-ФЗ «О потребительских кредитах».
вступили в силу для оформления отношений между заемщиками и кредиторами, устанавливают
ограничение максимального размера штрафа, который организации могут наложить на заемщиков,
и установить общие принципы взыскания просроченной задолженности.В соответствии с
настоящего Федерального закона, все профессиональные кредиторы, в состав которых входят кредитные организации,
МФО, ломбарды, потребительские кредитные кооперативы и сельскохозяйственное потребительское кредитование
кооперативы обязаны соблюдать общие правила выдачи кредитов физическим лицам.
Такая практика приносит защиту прав финансовых услуг.
потребителей на новый качественный уровень.

На что следует обратить внимание при выборе МФО:

• Каждая МФО должна зарегистрироваться в Государственном реестре микрофинансовых организаций.Вы можете проверить
  регистрация МФО в государственном реестре при посещении Банка России
  официальный сайт (cbr.ru).

Свидетельство о регистрации (копия) должно быть
в наличии в офисе МФО.

• Каждая МФО должна раскрывать полную стоимость кредита, то есть сумму основного долга, процентов
  и оплата комиссии за использование денег. Сравнивая сумму основного долга, проценты
  и оплата комиссионных, взимаемых различными МФО, вы сможете выбрать кредит, который
  обойдется вам дешевле.

С 14 ноября 2014 года Банк
Россия рассчитывает и публикует среднерыночную стоимость полной стоимости
потребительские кредиты по категориям потребительских кредитов ежеквартально. В момент
при заключении кредитного договора полная стоимость потребительского кредита не может превышать
более трети среднерыночной стоимости, рассчитанной Банком России для
полная стоимость потребительского кредита соответствующей категории и применяемая в
текущий квартал.

• Каждый MFO должен использовать формат единой таблицы соглашений для выдачи розничных
  кредиты.
• Каждая МФО должна дать вам время подумать — вы можете оформить кредит
  согласование условий, установленных МФО, в течение пяти дней после обращения в
  офис МФО для получения кредита.
• Если МФО является членом саморегулируемой организации (СРО), это дополнительная гарантия
  честный подход компании. Информация о том, входит ли компания в СРО
  обычно размещается на сайте компании.

Микрозайм — заем в размере
более миллиона рублей вывезено физическим лицом, физическим лицом
предприниматель или юридическое лицо по кредитному договору с МФО, кредит
кооператив (кредитный союз) или другая организация, уполномоченная выдавать микрозаймы.

В зависимости от назначения и размера микрозаймы можно разделить на три категории:

1. Микрозаймы предпринимателям

Кредиты в
сумма до одного миллиона рублей на открытие малого бизнеса, поддержку и
разработка.Эти кредиты могут быть предоставлены как юридическим, так и физическим лицам.
предприниматели.

Эти кредиты позволяют
предприниматели, чтобы начать свой бизнес, пополнить оборотный капитал, ликвидировать кассовый разрыв,
приобретать новое оборудование или брать дополнительные помещения в аренду.

Предпринимательский
займы обычно предоставляются на срок от одного до трех лет и обычно
без залога и согласно краткому списку запрашиваемых документов.

2. Потребительские микрозаймы

Кредитов выдано
гражданам (физическим лицам) для личных нужд на относительно длительный срок.Потребитель
кредиты чаще всего берутся на покупку крупного домашнего хозяйства.
техника, срочный ремонт автомобилей или жилья, лечение, путешествия,
образование или для других нужд.

МФО нормально
предлагать эти ссуды на срок от одного до шести месяцев, но их также можно взять
сроком до двух лет. Потребительский кредит обычно возвращает
несколько (еженедельно или ежемесячно) рассрочкой.

3. Микрозаймы до зарплаты

Кредитов выдано
гражданам (физическим лицам) для личных нужд на очень короткий срок.Эти ссуды
обычно вывозятся в случае срочных или непредвиденных расходов или задержек
в ежемесячных выплатах заработной платы. Проценты по этим кредитам выше, чем по потребительским.
ссуды или кредитные карты. Их преимущество в том, что оформление кредита осуществляется быстро и
легко, но стоит обратить внимание на высокую процентную ставку. Имеет смысл
возьмите такую ​​ссуду, если уверены, что ее обязательно вернете и
польза от его использования перевесит понесенные расходы.

Этот кредит имеет
срок от семи до тридцати дней и его размер составляет около половины
ежемесячный доход заемщика.Ссуда ​​до зарплаты и проценты за использование денег равны
возвращается единовременным платежом в последний день срока, указанного в ссуде
соглашение.

Получение микрозайма

• Прежде чем брать кредит в МФО, постарайтесь изучить возможные варианты и выбрать оптимальный
  схема в вашей ситуации. Если есть время, обратитесь за советом в несколько МФО. А
  правильно подобранный заем поможет решить ваши задачи и избежать новых
  проблемы.
• Обычно внутренний паспорт — единственный документ, который требуется для оформления кредита.Иногда
  компания может попросить вас предоставить второй документ, например, водительские права,
  заграничный паспорт, военный билет или другое удостоверение личности
  документ. Если вы хотите взять предпринимательскую ссуду, вас могут попросить
  предоставить документы, подтверждающие доходы и расходы вашего бизнеса.
• Перед тем, как оформить микрозайм, необходимо составить план его погашения.
  Если у вас есть возможность выбрать дату погашения, которая вам подходит, выберите
  дата после ожидаемой даты выплаты заработной платы, например, через 3–4 дня после этого,
  что позволит вам использовать удобные способы погашения и перевода кредита
  деньги на счет МФО вовремя.
• Если вы выплачиваете несколько кредитов или ссуд, планируйте выплаты по этим долгам
  в разные периоды месяца, чтобы распределить долговую нагрузку между
  аванс по заработной плате и основной оклад.
• Тщательно выбирайте сумму и срок кредита. Не вынимайте
  микрозайм, если вы не уверены, что сможете вернуть все
  заемные средства вовремя!
• Во многих странах рекомендуется, чтобы максимальная долговая нагрузка
  обслуживание всех кредитов и займов не должно превышать 30–40% от вашего ежемесячного
  доход.

Погашение микрозайма

• Задолженность считается полностью или частично погашенной при поступлении денег.
  зачислен на счет МФО. Используйте только проверенные платежные средства для погашения
  долга и всегда храните чеки или квитанции о переводе
  деньги на счет МФО.
• Федеральный закон от 21 декабря 2013 г. № 353-ФЗ «О потребительских кредитах»,
  устанавливает особую последовательность погашения долга (просроченные проценты, просроченная основная сумма
  задолженность, неустойка), если суммы, уплаченные заемщиком (физическим лицом) по ссуде
  соглашения не достаточно для полного исполнения обязательств заемщика.
• Если вы взяли микрозайм, но по каким-то причинам не можете его погасить
  в срок, указанный в кредитном договоре, или совершив регулярный платеж, вы
  немедленно уведомить об этом МФО. Если вы не можете выполнить свои
  обязательства по уважительной причине (потеря работы, болезнь, длительный бизнес
  поездка), МФО может отложить ваш платеж или предложить реструктуризацию долга.
• У вас есть право на досрочное погашение микрозайма. В случае раннего
  погашение, вы платите проценты только за фактический срок использования заемных
  средства.
• Микрофинансирование
  организация может
  в одностороннем порядке снижать проценты по кредиту, но закон запрещает увеличивать стоимость
  заем в одностороннем порядке.
• Вы всегда должны получить справку о погашении долга перед МФО — это
  документ будет полезен при возникновении разногласий.

Прочие услуги МФО

Некоторые МФО предлагают
граждане, чтобы брать ссуды и действовать как инвестор, вкладывая деньги в
МФО на определенный срок с фиксированной процентной ставкой.Важно понимать
что вложение в МФО не является депозитом, поскольку этот термин применим только к
договоры банковского вклада. Инвестиции в МФО не застрахованы государственным депозитом
система страхования и, следовательно, сохранность ваших средств не гарантируется
штат.

Инвестиции в
МФО имеют следующие особенности:

• МФО привлекают средства граждан в кредит на сумму не менее 1,5
  млн руб.
• МФО обычно предлагают инвесторам доход до 20% р.а. Если какая-то организация предлагает вам
  инвестировать под гораздо более высокие проценты, высока вероятность, что он привлечен
  в мошеннических операциях.
• МФО не обязаны досрочно возвращать средства инвестора, если это не так.
  оговаривается в соглашении.
• Многие МФО предлагают инвесторам застраховать свои средства коммерческой страховкой.
  Компания. Выберите МФО, застраховавшую свою ответственность в крупном страховании
  компании, таким образом вы повысите надежность своих вложений.

Защита прав и интересов заемщиков

Надзор за
соблюдение МФО требований законодательства осуществляется
Центральный банк Российской Федерации (Банк России), создавший
Служба защиты потребителей финансовых услуг и меньшинства
Акционеры как одно из его структурных подразделений. Также Роспотребнадзор (
Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и граждан
Благополучия) и Роскомнадзора (Федеральная служба по надзору в сфере РФ).
Связь, информационные технологии и СМИ) следят за соблюдением
требования некоторых федеральных законов.

МФО
интеграция в саморегулируемую организацию (реестр СРО, осуществляющих деятельность по микрофинансированию).
доступен на сайте Банка России) и сотрудничество с учреждением
финансовый омбудсмен может служить дополнительной гарантией соблюдения
права клиентов.

Законы, регулирующие микрофинансовую деятельность:

• ГК РФ
• Федеральный закон от 21 декабря 2013 г. № 353-ФЗ «О потребительских кредитах»;
• Федеральный закон от 29.07.2012 г.151-ФЗ от 2 июля 2010 г. «О микрофинансовой деятельности.
  и микрофинансовые организации ».

Была ли эта страница полезной?

Да
Нет

Последнее обновление: 19.03.2020

SEC.gov | Превышен порог скорости запросов

Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов.Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Укажите свой трафик, обновив свой пользовательский агент и включив в него информацию о компании.

Чтобы узнать о передовых методах эффективной загрузки информации с SEC.gov, в том числе о последних документах EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, в том числе о передовых методах, которые делают загрузку данных более эффективной, и о SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценарию. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу [email protected].

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.5dfd733e.1632177203.9223638c

Дополнительная информация

Политика интернет-безопасности

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности.В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная служба оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерное количество запросов. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC.gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

UNEC — Azərbaycan Dövlət İqtisad Universiteti — Страница не найдена

Российская Федерация — Трудовой кодекс Российской Федерации от 30 декабря 2001 г. с изменениями и дополнениями.

Закон

Корпоративные офисы | Прометрик

Язык

EnglishDeutschFrançaisEspañolItalianoCymraeg മലയാളം RomânăNederlandsGàidhligΕλληνικά 日本語 简体 中文 한국어 HrvatskiDanskMagyarBahasa IndonesiaPolskiPortuguês, BrasilSlovenščina

Страна

SelectAfghanistanÅland IslandsAlbaniaAlgeriaAmerican SamoaAndorraAngolaAnguillaAntarcticaAntigua & BarbudaArgentinaArmeniaArubaAscension IslandAustraliaAustriaAzerbaijanBahamasBahrainBangladeshBarbadosBelarusBelgiumBelizeBeninBermudaBhutanBoliviaBosnia & HerzegovinaBotswanaBouvet IslandBrazilBritish Индийский океан TerritoryBritish Virgin IslandsBruneiBulgariaBurkina FasoBurundiCambodiaCameroonCanadaCanary IslandsCape VerdeCaribbean NetherlandsCayman IslandsCentral African RepublicCeuta & MelillaChadChileChinaChristmas IslandClipperton IslandCocos (Килинг) IslandsColombiaComorosCongo — BrazzavilleCongo — KinshasaCook IslandsCosta RicaCôte d’IvoireCroatiaCubaCuraçaoCyprusCzechiaDenmarkDiego GarciaDjiboutiDominicaDominican RepublicEcuadorEgyptEl SalvadorEquatorial GuineaEritreaEstoniaEswatiniEthiopiaFalkland IslandsFaroe IslandsFijiFinlandFranceFrench GuianaFrench PolynesiaFrench Южный TerritoriesGabonGambiaGeorgiaGermanyGhanaGibraltarGreeceGreenlandGrenadaGuadeloupeGuamGuatemalaGuernse yGuineaGuinea-BissauGuyanaHaitiHeard & McDonald IslandsHondurasHong Kong SAR ChinaHungaryIcelandIndiaIndonesiaIranIraqIrelandIsle из ManIsraelItalyJamaicaJapanJerseyJordanKazakhstanKenyaKiribatiKosovoKuwaitKyrgyzstanLaosLatviaLebanonLesothoLiberiaLibyaLiechtensteinLithuaniaLuxembourgMacao SAR ChinaMadagascarMalawiMalaysiaMaldivesMaliMaltaMarshall IslandsMartiniqueMauritaniaMauritiusMayotteMexicoMicronesiaMoldovaMonacoMongoliaMontenegroMontserratMoroccoMozambiqueMyanmar (Бирма) NamibiaNauruNepalNetherlandsNew CaledoniaNew ZealandNicaraguaNigerNigeriaNiueNorfolk IslandNorth KoreaNorth MacedoniaNorthern Mariana IslandsNorwayOmanPakistanPalauPalestinian TerritoriesPanamaPapua Новый GuineaParaguayPeruPhilippinesPitcairn IslandsPolandPortugalPuerto RicoQatarRéunionRomaniaRussiaRwandaSamoaSan MarinoSão Tomé & PríncipeSaudi ArabiaSenegalSerbiaSeychellesSierra LeoneSingaporeSint MaartenSlovakiaSloveniaSolomon IslandsSomaliaSouth AfricaSouth Грузия и Южные Сандвичевы IslandsSouth KoreaSouth SudanSpa на Шри-ЛанкеBarthélemySt. Елена Китс и НевисСант. LuciaSt. MartinSt. Pierre & MiquelonSt. Винсент и ГренадиныСуданСуринамШпицберген и Ян-МайенШвецияШвейцарияСирияТайваньТаджикистанТанзанияТаиландТимор-ЛештиТогоТокелауТонгаТринидад и ТобагоТристан-да-КуньяТунисТурцияТуркменистанТурки и Кавалезию Внешние острова Виргинские островаУгандаУкраинаОбъединенные Арабские ЭмиратыВеликобританияСоединенные ШтатыУругвайУзбекистанВануатуВатиканВенесуэлаВьетнамУоллис и ФутунаЗападная СахараЙеменЗамбияЗимбабве

Состояние

SelectAlabamaAlaskaAmerican SamoaArizonaArkansasArmed сила (AA) Вооруженные силы (AE) Вооруженные силы (AP) CaliforniaColoradoConnecticutDelawareDistrict из ColumbiaFloridaGeorgiaGuamHawaiiIdahoIllinoisIndianaIowaKansasKentuckyLouisianaMaineMarshall IslandsMarylandMassachusettsMichiganMicronesiaMinnesotaMississippiMissouriMontanaNebraskaNevadaNew HampshireNew JerseyNew MexicoNew YorkNorth CarolinaNorth DakotaNorthern Mariana IslandsOhioOklahomaOregonPalauPennsylvaniaPuerto RicoRhode IslandSouth CarolinaSouth DakotaTennesseeTexasUtahVermontVirgin IslandsVirginiaWashingtonWest VirginiaWisconsinWyoming

Селективное соединение, связывающее MYC с высоким сродством, ингибирует взаимодействие MYC: MAX и MYC-зависимую пролиферацию опухолевых клеток

Создание клеточного анализа комплементации бимолекулярной флуоресценции (BiFC) для скрининга малых молекул, мешающих взаимодействию белка MYC: MAX

Для скрининга ингибиторов взаимодействия белков MYC: MAX мы использовали BiFC ^35,36,37 для мониторинга взаимодействия в живых клетках.Две конструкции, кодирующие комплементарные BiFC-фрагменты желтого флуоресцентного белка (YFP), слитые с полноразмерными MYC (MYC-YFP-C) и MAX (MAX-YFP-N) ³⁸ , соответственно (рис. 1A и S1A), котрансфицировали в клетки. , приводя к ядерному сигналу BiFC в результате взаимодействия MYC: MAX, в результате чего фрагменты YFP оказываются в непосредственной близости ³⁸ (рис. 1B, левая панель). Чтобы оптимизировать систему для целей скрининга, MYC-YFP-C и MAX-YFP-N временно коэкспрессировали в клетках HEK293 вместе с вектором полноразмерного голубого флуоресцентного белка (CFP) в качестве внутреннего контроля (рис.1С, верхние панели), после чего рассчитывали отношение интенсивностей флуоресценции BiFC / CFP. Замена дикого MYC-YFP мутантом MYC, лишенным домена bHLHZip (ΔbHLHZip), необходимого для взаимодействия с MAX, не давала сигналов BiFC, тем самым демонстрируя, что сигнал MYC: MAX BiFC является высокоспецифичным (рис. 1C, нижние панели). Строго стандартизованная разница средних (SSMD) -5 была рассчитана для клеток, экспрессирующих CFP вместе с MYC: MAX BiFC и MYCΔbHLHZip: MAX BiFC, соответственно, что свидетельствует о сильном пороге для отбора попаданий.Мы пришли к выводу, что эта система подходит для скрининга библиотек малых молекул для выявления ингибиторов взаимодействия MYC: MAX в клетках.

Рисунок 1

Идентификация и проверка малых молекул, нацеленных на взаимодействие белков MYC: MAX, с использованием клеточного анализа комплементации бимолекулярной флуоресценции (BiFC). ( A ) Схематическое изображение принципа анализа BiFC. MYC и MAX были слиты с двумя неактивными фрагментами YFP, образуя MYC-YFP-C и MAX-YFP-N соответственно.После гетеродимеризации MYC: MAX два фрагмента YFP превращаются в функциональный белок YFP. ( B ) Ядерная экспрессия MYC-eGFP (левая панель) и MYC-YFP-C и MAX-YFP-N BiFC (правая панель). ( C ) Клетки HEK293, котрансфицированные диким MYC-YFP-C или мутантом MYCΔbHLHZip-YFP-C (без MAX-взаимодействующей области bHLHZip MYC) и конструкциями MAX-YFP-N BiFC вместе с CMV-CFP, используемыми в качестве внутренняя ссылка. ( D ) Изображения клеток, обработанных соединением MYCMI-6 (нижняя панель) или носителем (верхняя панель).Канал CFP (левая панель) и канал YFP (BiFC) (правая панель). ( E ) Клетки HEK293, котрансфицированные MYC-YFP-C и MAX-YFP-N вместе с CMV-CFP и обработанные библиотекой набора NCI / DTP Diversity (25 мкМ каждого соединения) или носителем (DMSO) в течение 24 часов в 96-луночные планшеты. Отношение YFP ​​/ CFP рассчитывали относительно клеток, обработанных ДМСО. При отсечении 40% ингибирования было идентифицировано шесть хитовых соединений (MYCMI) ( F ). Влияние MYCMI на взаимодействия MYC: MAX, MYCN: MAX и GCN4: GCN4 с использованием анализа комплементации фрагмента люциферазы Gaussia (GLuc). .Конструкции слитого белка GLuc трансфицировали в клетки вместе с плазмидой CMV-Luc, обрабатывали указанными соединениями в течение 17 часов и анализировали с помощью двойного люциферазного анализа. Рассчитывали соотношение люминесценции люциферазы Gaussia / Firefly и нормализовали для клеток, обработанных ДМСО. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение 3–7 биологических экспериментов с 3–6 техническими повторами в каждом. Указаны значимые p -значения. ( G ) Вестерн-блот-анализ эндогенной экспрессии MYC в клетках HeLa после 24 часов обработки указанными MYCMI (10 мкМ), экспериментальным ингибитором MYC: MAX 10058-F4 ²⁴ (64 мкМ) и ингибитором BET JQ1 ¹⁸ (5 мкМ).Актин использовался в качестве контроля нагрузки. Полноразмерные блоты представлены в Приложении. Рис. S9A.

Идентификация и проверка малых молекул, избирательно нацеленных на взаимодействие MYC: MAX в клетках

Затем мы использовали библиотеку набора разнообразия из открытого химического репозитория NCI / DTP (http://dtp.cancer.gov), состоящую из соединений 1990 г. скрининг малых молекул, снижающих сигнал MYC: MAX BiFC по сравнению с сигналом CFP, как показатель потенциального ингибирования MYC: MAX в клетках.Соединения (25 мкМ), снижающие соотношение флуоресценции BiFC / CFP более чем на произвольный порог в 40% относительно контроля носителя (ДМСО) после 24-часовой обработки, считались положительными попаданиями. Шесть соединений, удовлетворяющих этому критерию (рис. 1E), но не влияющих на взаимодействие между факторами транскрипции bZip FOS и JUN (дополнительный рис. S2A), были выбраны для дальнейших исследований и были названы MYCMI ( MYC : M AX I ингибиторов).

Для проверки мы разработали другой анализ взаимодействия клеточных белков, основанный на использовании комплементарных фрагментов люциферазы Gaussia (GLuc) ³⁹ , слитых с полноразмерными MYC (MYC-GLuc-C) и MAX (MAX-GLuc- N) соответственно (Прил.Рис. S1B). Котрансфекция клеток HEK293 этими конструкциями вместе с люциферазой Firefly в двойном люциферазном анализе привела к высокой относительной активности GLuc, в то время как мутантный белок MYC-GLuc-C, лишенный домена взаимодействия Zip (MYCΔZip), дал только фоновую активность, что демонстрирует специфичность системы (Ян и др. ., рукопись в стадии подготовки). Обработка котрансфицированных клеток хитовыми молекулами (25 мкМ) показала, что все шесть соединений значительно ингибировали активности MYC: MAX GLuc (рис.1F), большинство из них более эффективно, чем ранее описанный ингибитор MYC: MAX 10058-F4 ²⁴ , который использовался в концентрации 64 мкМ. Самыми мощными среди молекул были MYCMI-6 и MYCMI-7. Все соединения ингибировали активность MYCN: MAX GLuc в той же степени, что и MYC: MAX, но не снижали активность GLuc гомодимерного фактора транскрипции bZIP GCN4, таким образом показывая селективность в отношении взаимодействий белок семейства MYC: MAX (рис. 1F).

Затем было исследовано влияние соединений на уровни эндогенного белка MYC.Два соединения, MYCMI-7 и MYCMI-9, снижали экспрессию белка MYC, как определено с помощью вестерн-блоттинга (фиг. 1G). В этой статье мы сосредоточили внимание на трех соединениях, MYCMI-6 (NSC354961), MYCMI-11 (NSC11656) и MYCMI-14 (NSC49689) (рис. 2A), которые не влияли на уровни белка MYC в большей степени, с целью идентификации соединения, специфически нацеленные на взаимодействие MYC: MAX, не влияя на другие активности MYC.

Фиг. 2

MYCMI ингибируют эндогенное взаимодействие MYC: MAX в клетках рака молочной железы и подавляют индуцированную MYC экспрессию целевого гена.( A ) Химические структуры MYCMI-6, MYCMI-11 и MYCMI-14. ( B — D ) in situ Proximity Ligation Assay (isPLA). ( B ) Эндогенные взаимодействия MYC: MAX (верхняя панель) и FRA1: JUN (нижняя панель), визуализированные isPLA в виде флуоресцентных красных точек в ядрах клеток (синие) после обработки указанными соединениями (10 мкМ) или ДМСО в течение 16 часов. isPLA выполняли с использованием пар антител MYC и MAX и антител FRA1 и JUN соответственно. В качестве отрицательного контроля использовали одно первичное антитело вместе с парой вторичных антител.Результаты isPLA основаны на трех биологических экспериментах для MYC: MAX и двух для FRA1: JUN. Показаны по одному репрезентативному эксперименту для каждого. ( C ) Количественная оценка MYC: MAX (левая панель) и FRA1: JUN (правая панель) — это PLA, представляющее среднее количество ядерных точек на клетку из трех микроскопических полей, нормированных на соответствующие значения для DMSO-обработанных клеток. p Указаны -значения. ( D ) Титрование указанных соединений в клетках MCF7 в течение 24 часов перед анализом MYC: MAX isPLA.Количественный анализ выполняли, как в ( C ). ( E ) Коиммунопреципитация эндогенного MAX с MYC из клеток MDA-MB231, обработанных 5 мкМ MYCMI-6 или ДМСО в течение 3,5 часов. 1 ^-я –4 ^-я переулков сверху; коиммунопреципитированный MAX, иммунопреципитированный MYC, общие уровни MAX и ACTIN, соответственно, по данным вестерн-блоттинга. Обратите внимание, что гели обрезаны. Полноразмерные версии без обрезков представлены в Приложении. Рис. S9B. ( F ) Ингибирование трансактивации MYC генов-мишеней ODC1, RSG16 и CR2, как определено анализом RT-qPCR, основанным на трех биологических экспериментах с тремя техническими повторами в каждом.Клетки U2OS-MYC-ER обрабатывали 100 нМ 4-гидрокси-тамоксифена (HOT) или без него в течение 4 часов, после чего добавляли ДМСО или указанные соединения (10 мкМ) в течение 24 часов перед экстракцией общей РНК. Кратные изменения экспрессии мРНК представлены относительно ДМСО в клетках, не обработанных HOT, после нормализации до GAPDH, используемого в качестве контрольного гена. Указаны значимые p -значения.

MYCMI-6 селективно ингибирует эндогенное взаимодействие MYC: MAX и экспрессию генов, индуцированную MYC

Для подтверждения ингибирующего действия выбранных MYCMI на эндогенное взаимодействие MYC: MAX в клетках, in situ Анализ близости лигирования (isPLA) ⁴⁰ выполняли с использованием антител MYC и MAX.Взаимодействия были визуализированы как флуоресцентные точки, в основном локализованные в ядре клетки с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2B), как сообщалось ранее ⁴⁰ . Обработка клеток рака молочной железы с помощью MYCMI-6, MYCMI-11 и MYCMI-14 в течение 24 часов значительно снизила сигналы MYC: MAX isPLA до 7%, 23% и 23% контрольных групп, обработанных DMSO, соответственно (рис. 2B и C ). Титрование показало IC ₅₀ для ингибирования MYC: MAX менее 1,5 мкМ для MYCMI-6 и приблизительно 6 мкМ для MYCMI-11 и MYCMI-14 с помощью isPLA (фиг.2D). Кроме того, коиммунопреципитация эндогенных белков MYC: MAX показала, что MYCMI-6 снижает взаимодействие белков MYC: MAX уже через 3 часа после обработки (фиг. 2E). Напротив, три соединения существенно не влияли на взаимодействие между факторами транскрипции bZip FRA1 и JUN (рис. 2B и C) или взаимодействие между MAX и белком bHLHZip MXD1 (MAD1) — внутриклеточным конкурентом MYC для MAX ^{41 , 42} (Suppl. Fig. S2B), таким образом дополнительно подтверждая MYC: MAX селективность соединений.

Чтобы исследовать влияние соединений на транскрипцию, управляемую MYC, мы использовали клетки U2OS, экспрессирующие слитый белок MYC-рецептор эстрогена (MYC-ER), активность которого регулируется лигандом 4-гидрокситамоксифен (HOT) ⁴³ . Обработка MYCMI-6 значительно снижала индуцированную HOT экспрессию трех ранее описанных прямых генов-мишеней MYC, ODC1, RSG16 и CR2 ^10,11 , в то время как MYCMI-11 и -14 в целом снижали экспрессию генов в меньшей степени, значима только для RSG16 (рис.2F). Взятые вместе, эти результаты подчеркивают MYCMI-6 как наиболее мощный и селективный ингибитор эндогенных белковых взаимодействий MYC: MAX и транскрипции, управляемой MYC, среди трех MYCMI.

MYCMI-6 — мощный и селективный ингибитор взаимодействия MYC: MAX bHLHZip

in vitro

Затем мы исследовали способность низкомолекулярных ингибиторов непосредственно воздействовать на взаимодействие MYC: MAX in vitro . С использованием рекомбинантных белков MYC и MAX (Прил.Рис. S1C) (рукопись в стадии подготовки). MST основан на смещении флуоресцентных молекул, движущихся в градиенте температуры (термофорез), который может быть нарушен взаимодействиями. В анализе взаимодействия MST MYC: MAX флуоресцентно меченый MAXbHLHZip объединяли с MYCbHLHZip, предварительно смешанным с соединением. Все три MYCMI, и в частности MYCMI-6, сдвинули термофорез MAX относительно ДМСО, указывая на то, что соединения влияют на конформацию MYC: MAX (фиг. 3A). Титрование MYCMI-6 в смеси с MYC и меченым MAX привело к сдвигу термофореза с K _d , равным 4.3 +/- 2,9 мкМ, хотя оказывает незначительное влияние на меченый MAX при предварительном смешивании с немеченым MAX (рис. 3B), что позволяет предположить, что MYCMI-6 хорошо различает взаимодействия MYC: MAX и MAX: MAX.

Рисунок 3

MYCMI-6 ингибирует взаимодействие белка MYC: MAX bHLHZip in vitro . ( A ) Микромасштабный термофорез (MST) флуоресцентно меченного MAX в анализе образования гетеродимера MYC: MAX на основе рекомбинантных белков. 1 мкМ MYCbHLHZip предварительно инкубировали с 50 мкМ соответствующего MYCMI перед смешиванием с 0.5–1 мкМ с меткой MAXbHLHZip. MST индуцировали, и относительные изменения флуоресценции (термофорез меченого MAX) ДМСО анализировали и сравнивали. ( B ) MST меченого MAXbHLHZip после титрования MYCMI-6, предварительно инкубированного с 1 мкМ MYCbHLHZip или с 1 мкМ MAXbHLHZip. Интенсивность флуоресценции меченого MAXbHLHZip относительного ДМСО наносили на график в зависимости от концентрации MYCMI-6. Было проведено по 3–4 эксперимента с техническими дубликатами. ( C ) Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) MYC: анализ образования гетеродимера MAX.MAXbHLHZip иммобилизовали с помощью процедуры амино-связывания с сенсорным чипом CM5. MYCbHLHZip, предварительно инкубированный с соединением или без него (как указано), вводили через MAX в течение 180 секунд, давали диссоциировать в течение 240 секунд и регенерировали. Вычтенные сенсограммы эталонной поверхности (без MAXbHLHZip) показаны из одного репрезентативного эксперимента. ( D ) SPR MYC: МАКС. Уровни связывания MYCbHLHZip с MAXbHLHZip анализировали и наносили на график в зависимости от концентрации MYCMI-6 или 10058-F4 соответственно.Было проведено три эксперимента соответственно.

Метод SPR — это высокочувствительный анализ для определения сродства между белком и лигандом и для измерения кинетики взаимодействия ⁴⁵ . В анализе взаимодействия SPR MYC: MAX MAXbHLHZip ковалентно присоединяли к сенсорному чипу, и MYCbHLHZip, предварительно смешанный с соединением, вводили по поверхности и после этого позволяли диссоциировать. MYCMI-6 ингибировал образование гетеродимера MYC: MAX с IC ₅₀ из 3.8 + / — 1,2 мкМ (фиг. 3C и D), тогда как экспериментальный ингибитор MYC 10058-F4 был менее эффективным (фиг. 3D и S3A). Ранее идентифицированный ингибитор взаимодействия MYC: MAX KJ-Pyr-9 ²⁷ не влиял на образование MYC: MAX до 10 мкМ (Supp. Fig. S3B).

MYCMI-6 связывается напрямую и выборочно с доменом MYC bHLHZip с высоким сродством

Чтобы определить, связывается ли MYCMI-6 непосредственно с MYC (или MAX), применяли MST и SPR. Домены bHLHZip MYC или MAX соответственно (Доп.Фиг. S1C) титровали и смешивали с 3 мкМ MYCMI-6. Наблюдались явные изменения в термофорезе при 1–15 мкМ MYC, в то время как для MAX явных изменений не наблюдалось, что указывает на связывание MYCMI-6 с MYC, но не с MAX при этих концентрациях (рис. 4A). Кроме того, MYCMI-6 не связывал контрольные белки BCL-X _L (дополнительный фиг. S4A) и бычий сывороточный альбумин (BSA) (дополнительный фиг. S4B). Сходные результаты были получены в эксперименте с обратным MST, в котором меченый MYC сохраняли фиксированную концентрацию при титровании MYCMI-6, показывая относительные изменения термофореза при концентрациях выше 100 нМ, подтверждая, что MYCMI-6 связывает MYC с аффинностью в низком микромолярном диапазоне (Suppl. .Рис. S4C).

Рисунок 4

MYCMI-6 селективно и с высоким сродством связывается с доменом MYC bHLHZip. ( A ) Анализ MST, измеряющий влияние MYCMI-6 на MYC и MAX, соответственно. Рекомбинантные белки MYC bHLHZip и MAX bHLHZip титровали, соответственно, в фиксированной концентрации (3 мкМ) MYCMI-6. Изменения флуоресценции измеряли и нормализовали к контролю (буферу). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для 6–8 биологических повторов. ( B ) Анализ SPR для определения сродства MYCMI-6 к MYC.Белок MYC bHLHZip иммобилизовали путем амино-связывания на сенсорном чипе CM5. MYCMI-6 вводили в различных концентрациях в кинетическом эксперименте. Контрольную поверхность вычитали из поверхности анализируемого вещества для создания сенсограммы. Скорости ассоциации и диссоциации (k _a = 9294 M − 1 с − 1, k _d = 0,02293 с − 1) определяли с использованием модели Ленгмюра 1: 1 в аппроксимирующих кривых программы Biacore Evaluation с постоянным Rmax, равным 43. RU (теоретическое Rmax), тем самым предполагая K _D , равное 2.5 мкМ со значением Chi ² 0,073. На сенсограмме показан один репрезентативный эксперимент. Четыре кинетических эксперимента были выполнены на двух различных сенсорных чипах, и было вычислено среднее значение K _D , равное 1,6 ± 0,5 мкМ. ( C ) Четыре эксперимента по равновесному связыванию MYC с MYCMI-6, суммированные на графике равновесного связывания, проведенных на двух различных сенсорных чипах. Аффинность связывания оценивалась по графику как 50% от Rmax, предполагая, что K _D составляет приблизительно 1.5–2 мкМ с экспериментальным Rmax 25–30 RU (теоретическое Rmax = 23 RU). Эксперименты SPR по связыванию MYCMI-6 с иммобилизованным MXD1 (MAD1) и белком MAX, соответственно, были включены в график. Сенсограммы приведены в Приложении. Фиг. S5A, C и D. ( D ) Контрольная сенсограмма, вычтенная из анализа SPR белка p53. Корбовый белок р53 был иммобилизован на 3000 RU, и MYCMI-6 был введен в различных концентрациях (теоретическое Rmax 56 RU).

Прямое связывание MYCMI-6 с MYC также анализировали с помощью SPR, где MYC bHLHZip иммобилизовали на чипе и в кинетических экспериментах вводили различные концентрации MYCMI-6.Скорости ассоциации и диссоциации соединения были получены из модели Ленгмюра 1: 1 после вычитания значений контрольных клеток, что позволяет предположить значение K _D 1,6 ± 0,5 мкМ (фиг. 4B). Из экспериментов по равновесному связыванию (Дополнение Фиг. S5A) значение K _D приблизительно 1,5-2 мкМ определяли по графику равновесного связывания (Фиг. 4C). Было обнаружено, что ранее идентифицированные ингибиторы взаимодействия MYC: MAX 10074-G5 и # 474 (аналог 10058-F4) ³² , используемые в качестве контрольных соединений, связываются с MYC с K _D s 28 и 15 мкМ соответственно (данные не показано).Однако мы не смогли обнаружить никакого связывания KJ-Pyr-9 до 8 мкМ в этом анализе (дополнительный рис. S5B). Кроме того, связывание MYCMI-6 с MAX, MXD1 (MAD1) (фиг. 4C и S5C и D), p53 (фиг. 4D), BSA (дополнительное фиг. S5E) и YFP (данные не показаны) было незначительным. Связывание с BCL-X _{и L} составляло только 10% от теоретического максимума при 2 мкМ MYCMI-6 (дополнительный рис. S5F). Таким образом, эксперименты MST и SPR предполагают, что MYCMI-6 связывает домен bHLHZip MYC напрямую, селективно и с аффинностью в низком микромолярном диапазоне.

MYCMI-6 селективно подавляет рост опухолевых клеток, управляемый MYC, с высокой эффективностью.

Далее мы рассмотрим, подавляет ли лечение MYCMI-6, -11 и -14 рост опухолевых клеток и коррелирует ли это со статусом MYC клеток. Для этой цели мы сначала использовали панель клеточных линий нейробластомы с усилением MYCN или без него. Поскольку было показано, что подмножество MYCN -неамплифицированных нейробластом демонстрирует нерегулируемую экспрессию (c) -MYC ⁴⁶ , мы исследовали экспрессию MYCN и MYC, а также общий уровень белков семейства MYC в шести клеточные линии с использованием антител, специфичных к MYCN, MYC или pan-MYC.В то время как все три клеточные линии с MYCN -амплификацией все экспрессировали высокие уровни белка MYCN, две из трех неамплифицированных клеточных линий MYCN экспрессировали MYC, хотя общий уровень белков семейства MYC был намного ниже в этих клеток, чем в линиях клеток, усиленных MYCN (фиг. 5A). Клеточные линии подвергали действию MYCMI-6 (6,25 мкМ), MYCMI-11 или MYCMI-14 (25 мкМ) или эталона 10058-F4 (64 мкМ) в течение 48 часов. Все четыре соединения снижали рост клеточных линий, усиленных MYCN , значительно сильнее, чем неамплифицированные клеточные линии MYCN (рис.5А). Эксперименты по титрованию подтвердили, что MYCMI-6 различает MYCN -амплифицированные и MYCN -неамплифицированные клетки клеток нейробластомы со средним ингибированием роста 50% (GI ₅₀ ), значениями 2,5-6 мкМ для MYCN . -амплифицированных клеточных линий и около 20 мкМ или выше для MYCN -неамплифицированных клеточных линий (фиг. 5B). Примечательно, что в клеточной линии SK-N-F1, которая по существу вообще не реагировала на MYCMI-6, MYCN или MYC практически не обнаруживались.Эти результаты демонстрируют, что ответ на MYCMI-6 и другие MYCMI в целом хорошо коррелировал с общим уровнем белков семейства MYC. Кроме того, MYCMI-6, MYCMI-11 и MYCMI-14 эффективно ингибировали независимый от закрепления рост MYCN -амплифицированных клеток нейробластомы со значениями GI ₅₀ <0,4, 5 и 0,75 мкМ, соответственно (рис. 5C и D ). Эти результаты демонстрируют, что MYCMI-6 явно является более мощным и избирательным из MYCMI, и поэтому мы сосредоточили оставшуюся часть этой работы на MYCMI-6.

Фигура 5

MYCMI предпочтительно ингибируют рост MYCN -амплифицированных по сравнению с неамплифицированными клетками нейробластомы, коррелирующими с экспрессией белков семейства MYC. ( A ) Вестерн-блоттинг экспрессии белков MYCN, MYC и pan-MYC в MYCN -амплифицированных клетках нейробластомы (IMR-32, Kelly и SK-N-DZ) и MYCN -неамплифицированных клетках нейробластомы ( СК-Н-Ф1, СК-Н-АС и СК-Н-РА). Как указано, использовали антитела Pan-MYC, распознающие все белки семейства MYC или антитела, специфичные для MYCN или MYC (см. Дополнительную информацию), соответственно.Полноразмерные варианты гелей представлены в Приложении. Рис. S10. ( B ) Указанные клеточные линии нейробластомы обрабатывали MYCMI-6 (6,25 мкМ), MYCMI-11 и MYCMI-14 (25 мкМ), контрольным соединением 10058-F4 (64 мкМ) или контролем ДМСО в течение 48 часов, после чего клетки рост / жизнеспособность измеряли с помощью анализа резазурина. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для 2–5 биологических повторов. p Указаны -значения. ( B ) Титрование MYCMI-6 на трех неамплифицированных MYCN и трех MYCN -амплифицированных линиях клеток, как указано, в течение 48 часов с последующим анализом резазурина.( C и D ) Независимый от якорения рост клеток нейробластомы, усиленных MYCN . ( C ) Независимый от закрепления рост клеток нейробластомы SK-N-DZ в 0,35% агарозе в 24-луночных планшетах в присутствии ДМСО или соединений в указанных концентрациях. Через 16 дней колонии окрашивали МТТ и подсчитывали количество колоний. Отображаются изображения колоний в лунках, обработанных 0,75 мкМ соединения, проанализированные через две недели (нижняя панель).( E и F ), визуализация эндогенного взаимодействия MYCN: MAX с помощью isPLA в MYCN -усиленных клетках SK-N-BE (2), выполненная, как описано в легенде к фиг. 2, с использованием антител MYCN и MAX. . ( E ) Изображения анализа isPLA. Клетки обрабатывали MYCMI-6 (2,5 мкМ) или ДМСО в течение 16 часов. В качестве отрицательного контроля использовали одно первичное антитело вместе с парой вторичных антител. ( F ) Количественная оценка MYCN: MAX isPLA, представляющая средний процент клеток, отображающих ядерные точки MYCN: MAX из трех микроскопических полей после обработки MYCMI-6 в указанных концентрациях в течение 16 часов, нормализованных до соответствующих значений для DMSO-обработанных клеток. p Указаны -значения. ( G ) Анализ RT-qPCR экспрессии мРНК выбранных генов-мишеней MYC / MYCN ⁴⁷ в MYCN -амплифицированных клетках Келли после обработки MYCMI-6 (2,5 мкМ) или ДМСО в течение 24 часов. Анализ основан на трех биологических экспериментах с тремя техническими повторами в каждом. Кратные изменения экспрессии мРНК в ответ на MYCMI-6 представлены относительно ДМСО после нормализации к общей РНК на клетку. p Указаны -значения.

Чтобы проверить, что MYCMI-6 ингибирует взаимодействие MYCN: MAX и транскрипционный выход MYCN в MYCN -амплифицированных клетках нейробластомы, мы выполнили MYCN: MAX isPLA и измерили экспрессию панели проверенных генов-мишеней семейства MYC в нейробластоме ⁴⁷ в ответ на MYCMI-6. На рис. 5E-G показано, что MYCMI-6 значительно ингибирует взаимодействие MYCN: MAX и экспрессию генов-мишеней MYC / MYCN уже в концентрации 2,5 мкМ, сохраняя при этом экспрессию MYCN и MAX (Suppl.Рис. S6). Это согласуется с результатами анализов взаимодействия MYCN: MAX GLuc после обработки MYCMI-6 (рис. 1F).

Более того, MYCMI-6 значительно подавлял рост клеток лимфомы Беркитта (BL) — еще одного классического примера опухоли, управляемой MYC, с транслокациями MYC в один из локусов иммуноглобулина — дозозависимым образом со средним GI ₅₀ 0,5 мкМ (рис. 6А).

Фигура 6

MYCMI-6 ингибирует рост и жизнеспособность опухолевых клеток MYC-зависимым образом, но не является цитотоксичным для первичных нормальных клеток человека.( A ) Титрование MYCMI-6 на клеточных линиях лимфомы Беркитта (BL) Mutu, Daudi и ST486. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение 2 биологических экспериментов, каждый с 3 техническими повторами. ( B ) Корреляция ответа MYCMI-6 (GI ₅₀ ) с уровнями мРНК MYC в линиях опухолевых клеток человека NCI-60, выделенных из CellMiner ™ и дополненных уровнями белка MYC из исследовательского проекта протеома Novartis или из литературы ( см. дополнительную таблицу S1). «Отзывчивый» и «менее отзывчивый»; линии клеток с положительными и отрицательными значениями log 10 GI ₅₀ соответственно.«Более высокий MYC» и «более низкий MYC»; линии клеток с более высокими и более низкими уровнями экспрессии MYC (мРНК MYC / белок), чем в среднем, соответственно. p Указаны -значения. ( C ) Рост фибробластов TGR-1 (wt), HO15.19 (нокаут MYC) и HOmyc3 (восстановленный MYC HO15.19) Rat1, как измерено с помощью анализа WST-1 после обработки MYCMI-6. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение 3–5 биологических экспериментов, каждый с 3 техническими повторами. p Указаны -значения. ( D ) Нормальные фибробласты человека IMR-90 и BJ и клеточная линия SK-N-DZ, усиленная MYCN , обрабатывали 12.5 мкМ MYCMI-6 или контроль (ДМСО) в течение 24 часов. Количество жизнеспособных и процент мертвых клеток определяли путем добавления CellTracker Green (окрашивает все клетки) и DAPI (окрашивает мертвые клетки) к клеткам и анализировали в каналах GFP и CFP с использованием флуоресцентного микроскопа. p Указаны -значения.

Для дальнейшего исследования, коррелируют ли уровни экспрессии MYC в опухолевых клетках с ответом на ингибирование роста, мы использовали данные GI ₅₀ из панели различных линий опухолевых клеток человека NCI-60, доступной для MYCMI-6 Программой развития терапии U.S. National Cancer Institute (DTP-NCI), извлеченный из поддерживаемого NIH CellMiner ™ версии 2.1 (https://discover.nci.nih.gov/cellminer). Поскольку дерегулированная экспрессия MYC часто проявляется на уровне белка, например, посредством стабилизации белка или дерегулированной трансляции мРНК ^14,48,49 , мы дополнили анализ данными по белку MYC, полученными от Novartis протеомного скаутского проекта SymAtlas (https: // proteomescout .wustl.edu / белки / 52581 / экспрессия) или где-либо еще в литературе (подробности см. в дополнительной таблице S1), а также разделили клеточные линии с высоким или низким уровнем мРНК MYC и / или высоким уровнем белка на категории «более высокий MYC» и «Низшие MYC» клеточные линии, соответственно, как указано в дополнительной таблице S1 и Suppl.Рис. S7A и B. Существовала значимая корреляция между ответом на MYCMI-6 и уровнями мРНК / белка MYC среди 60 линий опухолевых клеток, тогда как анализ, основанный только на мРНК MYC, не достиг значимости (Дополнение на рис. S7A. и Б). Классифицируя клеточные линии как «чувствительные» или «менее чувствительные» к MYCMI-6 на основе средних логарифмических значений GI ₅₀ , мы обнаружили, что 79% клеточных линий с более высокой экспрессией MYC показали хороший ингибирующий рост ответ на MYCMI-6. , в то время как 70% клеточных линий с более низкой экспрессией MYC были менее чувствительны (рис.6Б). Статистический анализ показал, что вероятность того, что линия клеток с «более высоким MYC» будет реагировать, была значительно выше, чем вероятность того, что линия клеток с более низким MYC будет менее восприимчивой, будет значительно выше, чем способность реагировать (рис. 6B). , таким образом демонстрируя сильную корреляцию между экспрессией MYC и ответом ингибирования роста на MYCMI-6 в линиях раковых клеток человека.

Обработка MYCMI-6 снижает рост и выживаемость клеток MYC-зависимым образом, но не является цитотоксичным для нормальных клеток человека.

Для дальнейшего изучения MYC-зависимости ответов ингибирования роста клеток MYCMI-6 мы использовали бессмертный H015.19 MYC-нулевые фибробласты крысы, полученные из Tgr1 (родительских клеток) и клеток H0Myc3, которые были восстановлены с помощью MYC ⁵⁰ . MYCMI-6 сильно ингибировал рост дикорастущих и реконструированных клеток, но не оказывал значительного влияния на рост нулевых MYC-клеток, таким образом показывая четкую разницу в ответе между экспрессирующими MYC и MYC-дефицитными клетками (рис. 6C), что дополнительно подтверждает вывод что клеточный ответ после обработки MYCMI-6 является MYC-зависимым.

Далее мы рассмотрели вопрос о том, дифференцируют ли клеточные ответы на лечение MYCMI-6 между MYC-зависимыми опухолевыми клетками и нормальными первичными клетками человека.Как показано на фиг. 6D, MYCMI-6 (12,5 мкМ) резко увеличивал гибель клеток и уменьшал количество клеток в MYCN -усиленных клетках нейробластомы SK-N-DZ после 24-часовой обработки, но оказывал лишь незначительное влияние на количество жизнеспособных клеток. и процент мертвых клеток в нормальных фибробластах легкого (IMR-90) и крайней плоти (BJ) человека. Мы пришли к выводу, что MYCMI-6 хорошо переносится нормальными клетками человека в концентрации, которая была высокотоксичной для MYC-зависимых опухолевых клеток, показывая хорошее различение между раковыми клетками и нормальными клетками в ответ на MYCMI-6, что дает хорошее терапевтическое окно для это соединение.

MYCMI-6 вызывает массивный апоптоз и снижает пролиферацию опухолевых клеток, плотность микрососудов опухоли и взаимодействие MYC: MAX в MYC-зависимой модели опухоли ксенотрансплантата

in vivo

Чтобы проанализировать влияние MYCMI-6 на физиопатологию опухоли in vivo , мы использовали модель опухоли ксенотрансплантата мыши, основанную на человеческих MYCN -усиленных клетках нейробластомы SK-N-DZ. Опухолевые клетки инъецировали в бок бестимусных голых мышей и позволяли образоваться опухолям, после чего MYCMI-6 или носитель вводили ежедневной внутрибрюшинной инъекцией в дозе 20 мг / кг веса тела в течение 1-2 недель.Окрашивание срезов опухоли TUNEL выявило резкое увеличение апоптотических областей в опухолях (рис. 7A и B) и значительное увеличение непролиферативных областей, как определено окрашиванием Ki67 (рис. 7C и D) в опухолях из Мышей, получавших MYCMI-6, по сравнению с мышами, получавшими носитель. Окрашивание эндотелиальных клеток CD31 выявило значительно сниженную плотность микрососудов (MVD) у мышей, получавших MYCMI-6, по сравнению с мышами, получавшими носитель (фиг. 7C, E и F). Кроме того, опухоли от мышей, получавших MYCMI-6, демонстрировали признаки некроза и кровоизлияния и имели более выраженную рубцовую ткань, чем мыши, получавшие носитель (Дополнение.Рис. S8A). Важно отметить, что анализ isPLA показал значительное снижение взаимодействия MYCN: MAX в опухолях от MYCMI-6- по сравнению с мышами, получавшими носитель (рис. 7G и H), что указывает на то, что MYCMI-6 достигает своей цели и проявляет активность против нее. vivo . Введение MYCMI-6 хорошо переносилось мышами с лишь незначительными временными эффектами на массу тела (дополнительный рис. S8B).

Фигура 7

MYCMI-6 ингибирует взаимодействие MYC: MAX, индуцирует апоптоз и снижает пролиферацию опухолевых клеток и микроваскуляризацию в модели опухоли нейробластомы мыши, усиленной MYCN , модели in vivo .SK-N-DZ MYCN — ксенотрансплантат нейробластомы, усиленный опухоли, достигающие объема 100–200 мм ³ обрабатывали MYCMI-6 (20 мг / кг массы тела) или носителем, вводимым внутрибрюшинно. ежедневно в течение 1-2 недель. ( A ) Апоптоз определяли окрашиванием TUNEL (зеленый) опухолевых тканей мышей, обработанных MYCMI-6 (две верхние панели) или носителем (две нижние панели), с контрастированием DAPI (синий). Типичные изображения показаны при увеличении 1,25X (панели 1 и 3 сверху, полоса = 800 мкМ) или 40X (панели 2 и 4, полоса = 50 мкМ).( B ) Количественная оценка окрашивания TUNEL, нормализованного по всем областям опухоли, как определено с помощью DAPI у трех мышей MYCMI-6 и трех мышей, обработанных носителем. ( C ) Клеточная пролиферация и плотность микрососудов, определяемые окрашиванием Ki67 (зеленый) и CD31 (красный), соответственно, опухолевых тканей мышей, обработанных MYCMI-6 (две верхние панели) или носителем (две нижние панели), соответственно. и окрашен DAPI (синий). Репрезентативные изображения сделаны с увеличением 1,25X (панели 1 и 3 сверху, полоса = 800 мкМ) или 20X (панели 2 и 4).( D ) Количественная оценка Ki67-отрицательных областей, нормализованных по отношению к целым областям опухоли с помощью DAPI от трех мышей MYCMI-6 и трех мышей, обработанных носителем. ( E ) плотность микрососудов, визуализированная по окрашиванию CD31 в красном канале при 1,25-кратном увеличении, как в ( C ). ( F ) Количественная оценка окрашивания CD31, нормализованного для целых областей опухоли, у трех мышей, которым вводили MYCMI-6, и трех мышей, которым вводили носитель. ( G ) Обнаружение взаимодействия белка MYCN: MAX с помощью isPLA выполняли на опухолевой ткани мышей, обработанных MYCMI-6 (верхняя панель) или носителем (средняя панель) с использованием антител против MYCN и MAX.Репрезентативные изображения были сделаны при 40-кратном увеличении. ( H ) Количественная оценка сигналов MYCN: MAX isPLA в опухолевой ткани от мышей, которым вводили MYCMI-6 и носитель, представлены в виде среднего количества точек из четырех случайно выбранных микроскопических полей от мышей, обработанных MYCMI-6, нормализованных к соответствующим значениям от носителя -обработанных мышей. Указаны значения SEM и p .

Таким образом, введение MYCMI-6 MYCN-зависимым мышам, несущим опухоль, привело к снижению взаимодействия MYCN: MAX, пролиферации опухолевых клеток и MVD и к индукции апоптоза в опухолевой ткани, не вызывая серьезных побочных эффектов.

DeepKnowledge | Свяжитесь с нами

Дубай, ОАЭ

Головной офис
Офис 3001, Prime Tower,
Marasi Drive Business Bay,
P.O. Box 23390
Тел .: +971 4 439 0630
Факс: +971 4366 1043

Амман, Иордания

Строение No.58, 4 этаж
Центр Аль-Хуссин
Улица Шейкер Бин Заид, Аль-Шмисани
Почтовый ящик 13556
Амман 11942, Иордания
Тел .: +962 6 5154294
Факс: +962 6 5162296

Эр-Рияд, Саудовская Аравия

Бизнес-центр «Лидеры» (2)
Улица Аль-Тахасуси,
Аль-Мухаммадия, округ
П.О. КОРОБКА 67356
Эр-Рияд 11596, KSA

Тел .: +966 11 4

4

Стамбул, Турция

Sabancı Üniversitesi Lojmanları B-27,
34956, Тузла
Стамбул, Турция
Тел .: +90 216 483 97 70
Главный офис: +90 530 353 39 32
Факс: +90 312 219 73 59

Анкара, Турция

Mustafa Kemal Mh.2152.Sk,
Kent İş Merkezi №: 2 / B,
06510 Чанкая Анкара, Турция
Тел .: +90 312 219 76 28
Главный офис: +90 533 652 61 61
Факс: +90 312 219 73 59

Каир, Египет

14 Al Nagah Street,

Гелиополис,
Каир, Египет
Тел .: +202 269 08517
Факс: +202269 08516

.